天然植物有效成分的提取新技术——复合生物酶解技术
江苏天琦生物科技有限公司为你详细介绍天然植物有效成分的提取新技术——复合生物酶解技术：
酶是生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。 生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的，应用常规提取设备即可完成，操作简便，成本低廉。 1原理 酶法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。由于酶反应具有高度的专一性，决定了酶解方法除杂的高效性。 2酶的种类 2．1 用于天然植物细胞破壁的酶 2．1．1 纤维素酶 纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物，纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝，构成了植物细胞壁的框架，在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅)，形成植物细胞壁的基本结构。在干燥植物中纤维素约占总重的l／3～l／2。 纤维素酶具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用，它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3个组分。最适pH值4～5，最佳作用温度40~60℃。 2．1．2半纤维素酶 半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分，约占植物干重的35％。含量仅次于纤维素。 半纤维素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等内切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。具有消化植物细胞壁的作用。 2．1．3果胶酶 果胶质属于黏液质类，是植物细胞的正常产物，多见于植物的地下部分及种子中。 果胶酶是分解果胶质的聚糖水解酶、果胶质酰基水解酶的一类复合酶的总称。固体的呈浅黄色，易溶于水；液体的呈棕褐色。最适作用温度45-50 ℃，作用pH值3～6。 2．2用于分离精制、改善提取澄清度的酶 有木瓜蛋门酶、菠萝蛋白酶、葡萄糖苷酶、转糖苷酶。 3应 用 3．1酶法提取 3．1．1含生物碱类成分酶法提取 以黄连提取盐酸小檗碱为例：将黄连粗粉按每g加入10 U量的纤维素酶(活力单位2 000 U·g-1)，充分混匀，加3倍量水，用0．3％硫酸调pH值至5后浸泡，在40℃下恒温水浴90 min，将黄连及0．3％硫酸作溶剂置于渗漉筒中，浸渍、渗漉，收集渗漉液，用石灰乳调pH值至10～12，沉淀，抽滤，滤液用浓盐酸调pH值至l～2，加精制食盐使含盐量达7％，充分搅拌，静置24 h，滤过，i)l=淀，在60 ℃下干燥，得盐酸小檗碱粗品。用薄层扫描法进行含量测定，结果表明：黄连经酶法提取后，所得盐酸小檗碱含量为4．2％，而未经酶处理的盐酸小檗碱含量平均为2．5％，两种工艺样品经薄层层析鉴别，提取的成分一致。 3．1.2含黄酮类成分的酶法提取 以葛根提取总黄酬为例：将葛根粉碎成约l cm左右，用3倍水浸泡，加盐酸调pH至4，加0．5％纤维素酶(活力单位约2 000 u·g-1)，充分搅拌，置40℃恒温水浴中1．5 h，加5倍95％乙醇回流提取1 h，滤过，得第一次提取液备用；药渣加5倍60％乙醇回流提取0．5 h，滤过，得第二次提取液；两次提取液合并，回收乙醇，离心，取上清液，用正丁醇萃取3次，挥发尽正丁醇，得葛根总黄酮。用紫外分光光度法测定表明，葛根经酶法提取后所得葛根总黄酮含量为8．68％，而未经酶法提取的含量为7．68％。两种T艺样品经薄层层析比较，成分一致。 3．1．3含香豆素成分的酶法提取 以补骨脂提取补骨脂素、异补骨脂素为例：每g补骨脂加入20U纤维素酶，用硫酸调pH值至4．5，充分搅拌，43 cC恒温水浴3 h，放冷至室温后，用0．1 tool·L-1氢氧化钠溶液调pH值至中性，加乙醇使浸泡液的含醇量达50％，体积为补骨脂的10倍，浸泡30 d。用薄层扫描法测定提取液中补骨脂素含量，结果补骨脂经酶法提取的含量0．1814％，而未加酶提取的含量为O．1469％。 3．1．4含多糖类成分的酶法提取 以香菇提取香菇多糖为例：香菇的细胞壁由蛋白质、几丁质和纤维素组成，结构紧密，一般的提取方法因难以破坏其细胞壁，提取效果不理想。采用纤维素酶和菠萝蛋白酶在香菇多糖的提取过程中进行酶解处理，可以大大提高可溶性同形物的提取效果；香菇提取液除去蛋白质后用乙醇沉淀，得到6种多糖的混合物，测定其含量，兀酶处理的含32％，酶法提取的含50％左右。 此外，用纤维素酶处理穿心莲提取穿心莲内酯；用OL--淀粉酶、OL--葡萄糖苷酶、环糊精葡聚糖转移酶处理银杏叶提取黄酮类；用纤维素酶和蛋闩酶处理灵芝提取同形物等已应用于生产中。 3．2酶法分离精制 天然植物在采用常规提取的煎煮过程中，蛋门质遇热凝固体，淀粉糊化，影响有效成分的煎出，并给提取液的分离带来困难。针对水提取液中所含的杂质类型，采用相应的酶(木瓜蛋门酶分解蛋门质、果胶酶分解果胶、淀粉酶分解淀粉)，将其降解为小分子物质或分解除去，可改善水提取液的过滤困难问题，提高液体制剂的澄清度和制剂纯度。 以决明子提取总蒽醌、青皮提取陈皮苷为例：决明子中加热水少许，温浸30 min，用10倍水煎煮2 h，再8倍水煎煮1．5 h，滤过，合并两次滤液，浓缩至物料与药液l：5，均分为5份，分别加入复合蛋白酶I(调节到60～70℃)、复合蛋白Ⅱ(55-60 ℃)、果胶酶(55-65℃)、澄清剂(50～60℃)、对照空白，保温2 h，定时搅拌，离心(3 000 rpm)，过滤，将上清液和沉淀分别蒸干，结果用复合蛋白酶I处理效果较好，总蒽醌含量0．717％，而空白对照为0．223％。青皮的试验，用果胶酶处理效果较好，陈皮苷含量6．26％，而空白对照为4．47％。 4技术关键 4．1酶的种类 采用酶法处理时，所用酶的种类应根据天然植物中的有效成分，辅助成分及物料的性质来确定，不能一概而论。若采用复合酶，则复合酶的组成、比例也应筛选。关于酶的用量，需在含相同底物的提取液中加入不同量的酶进行酶解。通过测定酶解产物的含量，以确定最适用量。 4．2酶解温度 在其他条件相同的情况下，将酶反应液分成若干份，分别控制在不同的温度下进行酶解反应，测定酶反应的活性。以酶反应活性对温度作图，曲线上酶活性最高点所对应的温度就是该反应的最适温度，此时酶表现出最大的活性。若温度超出该范围，酶活性逐渐降低。 4．3酸碱度 酶反应需在一定pH值条件下进行，不同的天然植物使用酶的种类不同，酶解时的最佳pH值应根据试验来确定。 4．4酶解时间 不同酶的最佳酶解时间需通过试验确定。 4．5酶解工艺 采用酶反应法时，天然植物的粒度、浸泡时间、酶加入时间、搅拌速度等都影响酶解效果，需以目标成分含量、酶的活性、对药效的影响、能否与其他方法联用等指标进行综合优选
酶是生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。 生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的，应用常规提取设备即可完成，操作简便，成本低廉。 1原理 酶法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。由于酶反应具有高度的专一性，决定了酶解方法除杂的高效性。 2酶的种类 2．1 用于天然植物细胞破壁的酶 2．1．1 纤维素酶 纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物，纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝，构成了植物细胞壁的框架，在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅)，形成植物细胞壁的基本结构。在干燥植物中纤维素约占总重的l／3～l／2。 纤维素酶具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用，它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3个组分。最适pH值4～5，最佳作用温度40~60℃。 2．1．2半纤维素酶 半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分，约占植物干重的35％。含量仅次于纤维素。 半纤维素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等内切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。具有消化植物细胞壁的作用。 2．1．3果胶酶 果胶质属于黏液质类，是植物细胞的正常产物，多见于植物的地下部分及种子中。 果胶酶是分解果胶质的聚糖水解酶、果胶质酰基水解酶的一类复合酶的总称。固体的呈浅黄色，易溶于水；液体的呈棕褐色。最适作用温度45-50 ℃，作用pH值3～6。 2．2用于分离精制、改善提取澄清度的酶 有木瓜蛋门酶、菠萝蛋白酶、葡萄糖苷酶、转糖苷酶。 3应 用 3．1酶法提取 3．1．1含生物碱类成分酶法提取 以黄连提取盐酸小檗碱为例：将黄连粗粉按每g加入10 U量的纤维素酶(活力单位2 000 U·g-1)，充分混匀，加3倍量水，用0．3％硫酸调pH值至5后浸泡，在40℃下恒温水浴90 min，将黄连及0．3％硫酸作溶剂置于渗漉筒中，浸渍、渗漉，收集渗漉液，用石灰乳调pH值至10～12，沉淀，抽滤，滤液用浓盐酸调pH值至l～2，加精制食盐使含盐量达7％，充分搅拌，静置24 h，滤过，i)l=淀，在60 ℃下干燥，得盐酸小檗碱粗品。用薄层扫描法进行含量测定，结果表明：黄连经酶法提取后，所得盐酸小檗碱含量为4．2％，而未经酶处理的盐酸小檗碱含量平均为2．5％，两种工艺样品经薄层层析鉴别，提取的成分一致。 3．1.2含黄酮类成分的酶法提取 以葛根提取总黄酬为例：将葛根粉碎成约l cm左右，用3倍水浸泡，加盐酸调pH至4，加0．5％纤维素酶(活力单位约2 000 u·g-1)，充分搅拌，置40℃恒温水浴中1．5 h，加5倍95％乙醇回流提取1 h，滤过，得第一次提取液备用；药渣加5倍60％乙醇回流提取0．5 h，滤过，得第二次提取液；两次提取液合并，回收乙醇，离心，取上清液，用正丁醇萃取3次，挥发尽正丁醇，得葛根总黄酮。用紫外分光光度法测定表明，葛根经酶法提取后所得葛根总黄酮含量为8．68％，而未经酶法提取的含量为7．68％。两种T艺样品经薄层层析比较，成分一致。 3．1．3含香豆素成分的酶法提取 以补骨脂提取补骨脂素、异补骨脂素为例：每g补骨脂加入20U纤维素酶，用硫酸调pH值至4．5，充分搅拌，43 cC恒温水浴3 h，放冷至室温后，用0．1 tool·L-1氢氧化钠溶液调pH值至中性，加乙醇使浸泡液的含醇量达50％，体积为补骨脂的10倍，浸泡30 d。用薄层扫描法测定提取液中补骨脂素含量，结果补骨脂经酶法提取的含量0．1814％，而未加酶提取的含量为O．1469％。 3．1．4含多糖类成分的酶法提取 以香菇提取香菇多糖为例：香菇的细胞壁由蛋白质、几丁质和纤维素组成，结构紧密，一般的提取方法因难以破坏其细胞壁，提取效果不理想。采用纤维素酶和菠萝蛋白酶在香菇多糖的提取过程中进行酶解处理，可以大大提高可溶性同形物的提取效果；香菇提取液除去蛋白质后用乙醇沉淀，得到6种多糖的混合物，测定其含量，兀酶处理的含32％，酶法提取的含50％左右。 此外，用纤维素酶处理穿心莲提取穿心莲内酯；用OL--淀粉酶、OL--葡萄糖苷酶、环糊精葡聚糖转移酶处理银杏叶提取黄酮类；用纤维素酶和蛋闩酶处理灵芝提取同形物等已应用于生产中。 3．2酶法分离精制 天然植物在采用常规提取的煎煮过程中，蛋门质遇热凝固体，淀粉糊化，影响有效成分的煎出，并给提取液的分离带来困难。针对水提取液中所含的杂质类型，采用相应的酶(木瓜蛋门酶分解蛋门质、果胶酶分解果胶、淀粉酶分解淀粉)，将其降解为小分子物质或分解除去，可改善水提取液的过滤困难问题，提高液体制剂的澄清度和制剂纯度。 以决明子提取总蒽醌、青皮提取陈皮苷为例：决明子中加热水少许，温浸30 min，用10倍水煎煮2 h，再8倍水煎煮1．5 h，滤过，合并两次滤液，浓缩至物料与药液l：5，均分为5份，分别加入复合蛋白酶I(调节到60～70℃)、复合蛋白Ⅱ(55-60 ℃)、果胶酶(55-65℃)、澄清剂(50～60℃)、对照空白，保温2 h，定时搅拌，离心(3 000 rpm)，过滤，将上清液和沉淀分别蒸干，结果用复合蛋白酶I处理效果较好，总蒽醌含量0．717％，而空白对照为0．223％。青皮的试验，用果胶酶处理效果较好，陈皮苷含量6．26％，而空白对照为4．47％。 4技术关键 4．1酶的种类 采用酶法处理时，所用酶的种类应根据天然植物中的有效成分，辅助成分及物料的性质来确定，不能一概而论。若采用复合酶，则复合酶的组成、比例也应筛选。关于酶的用量，需在含相同底物的提取液中加入不同量的酶进行酶解。通过测定酶解产物的含量，以确定最适用量。 4．2酶解温度 在其他条件相同的情况下，将酶反应液分成若干份，分别控制在不同的温度下进行酶解反应，测定酶反应的活性。以酶反应活性对温度作图，曲线上酶活性最高点所对应的温度就是该反应的最适温度，此时酶表现出最大的活性。若温度超出该范围，酶活性逐渐降低。 4．3酸碱度 酶反应需在一定pH值条件下进行，不同的天然植物使用酶的种类不同，酶解时的最佳pH值应根据试验来确定。 4．4酶解时间 不同酶的最佳酶解时间需通过试验确定。 4．5酶解工艺 采用酶反应法时，天然植物的粒度、浸泡时间、酶加入时间、搅拌速度等都影响酶解效果，需以目标成分含量、酶的活性、对药效的影响、能否与其他方法联用等指标进行综合优选
